液体活检在癌症检测中的应用

癌症是全球第二大死亡原因¹，实施早筛刻不容缓。随着我们对癌症更深入的理解，更新更灵敏的检测技术也不断涌现。

液体活检是其中最*先进的新技术， 这是一种通过非侵入性手段对血液、尿液、唾液和粪便等样本中的蛋白质、miRNA、外泌体、循环肿瘤细胞(CTCs)和循环肿瘤DNA (ctDNA)等肿瘤特异性分子标志物进行分离和检测的技术，它有可能改变早期癌症检测和疾病监测的方式。

2013年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了首*个基于CTC枚举的液体活检测试。三年后的2016年，批准了第二个测试，这是首*个基于PCR的ctDNA检测，旨在检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血液中的表皮生长因子受体(EGFR)基因突变。

液体活检中基于PCR的ctDNA检测被认为是极具吸引力的分子癌症筛查方法，因为ctDNA具有高度特异性，非常敏感，且易分离和检测。

总的来说,液体ctDNA检测与传统的组织检活检相比，液体活检的成本相对较低，并且更容易在护理点使用常规临床方法或者point-of-care方法进行检测。

ctDNA是肿瘤释放到血液中的小DNA片段，ctDNA的水平代表了相对的肿瘤负担。研究表明，对于乳腺癌，ctDNA检测可以在放射证据出现前5个月发现疾病进展²。

此外，ctDNA显示出更高的乳腺癌检出率和与肿瘤变化更强的相关性，与传统的蛋白质癌症生物标志物CA15-3相比，能更早地反映出对治疗效果的反应。与CA15-3相比，ctDNA的其他优势包括可通过非侵入性手段分析癌症基因组和转移异质性的分子能力。

本文主要分享使用迈迪安开发的 Specimen-specific™ 特定样本类型qPCR预混液在液体活检中的研究进展。

 

基因分型筛查：非小细胞肺癌(NSCLC)

在治疗前对癌症患者进行基因分型对选择合适的治疗方法和药物至关重要。某些癌症会出现特定的基因突变，影响患者对治疗的反应，比如说增加患者对药物的敏感性，或者是更常见的增加患者对药物的耐药性。

EGFR的外显子19缺失突变是肺癌中最常见的突变之一，它对EGFR酪氨酸激酶抑制物(非小细胞肺癌NSCLC的主要治疗药物）极其灵敏。

目前，有几种检测EGFR突变的方法已经获得欧盟和FDA的批准，并用于肺癌患者的初始基因分型、监测具有耐药性的克隆型和评估对治疗的反应⁴。

但是这些检测需要在进行qPCR之前提取DNA，这不仅增加了检测的复杂性和成本，而且还可能引入污染和抑制物，从而影响检测的准确性。

为了优化操作流程，体外诊断开发商为EGFR突变检测单独开发了专门的DNA样品制备试剂盒⁵。更理想的情况是，完全免除DNA的提取和纯化步骤，直接对样本进行EGFR突变的qPCR检测。 

以下研究中验证了使用Meridian迈迪安的Air-Dryable™可风干血液直扩qPCR预混液（MDX092) 检测单拷贝EGFR exon-19突变的灵敏度（图1)。 反应中对比了Air-Dryable™可风干血液直扩qPCR预混液风干体系和液体体系的扩增性能，显示出使用风干体系可以增加样本上样量从而增加灵敏度的优势。  

图 1. 免核酸提取qPCR检测降低操作复杂性并提高检测灵敏度

对血浆样本中已知浓度的EGFR exon-19 突变型和野生型（阴性对照）进行qPCR扩增。扩增设置为：95°C 3分钟；95°C 10秒，60°C 25秒，50个循环。使用MDX092风干的其中一个优势就是可以在反应中加入更多的样本。如图A中显示，使用液体扩增体系时每个反应通常加入35%提取的核酸作为模板（橙色），而使用风干扩增体系时则每个反应可加入100%提取的核酸作为模板（黄色），因此检测灵敏度可提高近10-fold。图B显示该灵敏度的提高可在20uL反应中实现单拷贝E19del-EGFR的检测（图B，淡蓝色），EGFR Exon-19野生型gDNA为阴性对照（棕色）。

 

血浆样本通常是EGFR突变检测的首*选样本类型，因为全血样本有可能发生溶血，易对实验室检测造成干扰。而血浆样本必须用抗凝血剂稳定以防止凝血，这些添加剂则会对PCR扩增引起抑制作用。 
 

另一项实验中使用了Air-Dryable™可风干血液直扩qPCR预混液（MDX092) 在EGFR exon-19突变的检测中对抗凝血剂肝素的抑制物耐受性（图2），显示这种特定样本类型预混液与常规预混液相比另一个优势，就是在体系中有抑制物存在时具有更强的性能，可提高免提取qPCR检测的灵敏度。 

  

图2. 20%肝素-血浆的qPCR扩增灵敏度

检测游离DNA（cfDNA）中表皮生长因子受体（EGFR）突变是非小细胞肺癌（NSCLC）分子诊断的辅助工具，特别是在无法获得足够肿瘤组织标本的情况下。本实验将0.1%的E19del-EGFR突变型与99.9%的EGFR野生型DNA按比例加入到含有20%肝素的血浆样本，分别使用Air-Dryable™ 可风干血液直扩qPCR预混液（MDX092，红色）与 A）KAPA Probe Force（蓝色）和 B）TaqMan™ Universal Master Mix（绿色）进行对比，检测扩增突变的能力。结果显示，与对比试剂相比，MDX092对血浆和肝素抗凝剂具有更强的耐受性和更好的灵敏度，可以检测到10个拷贝的突变基因。

 

利用lncRNA生物标志物检测早期癌症

非编码RNA (non-coding RNA, ncRNAs)是一新的癌症分子生物标志物。虽尚未获得批准，但近年来引起了业界学者的极大兴趣。

在生物标志物领域，RNA比DNA更有优势，因为RNA分子有不同的表达模式，特别是长链非编码RNA (lncRNAs)，具有高度的组织和疾病状态特异性，其RNA的表达比DNA更具动态性，可根据细胞的内部需求而波动。

长非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于200个核苷酸的RNA转录物，没有或有有限的蛋白质编码潜力，通过不同的分子机制发挥不同的生物学功能。研究表明，lncRNA在癌症进展中起着关键作用，可以作为诊断和预后标志物，识别分期特异性肿瘤³。

其中一个常用的LncRNA是MALTA1 (metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1，转移相关肺腺癌转录本1)，它是一个8.8kb长，作为癌症诊断和预后的潜在生物标志物，在过去的几年里引起了人们的极大关注。

研究表明，MALAT1 在正常组织中广泛表达，其异常表达与癌症病理生理和疾病进展有关7。对肺癌相关恶性胸腔积液(LC-MPE)诊断检测的研究发现，MALAT1和CEA联合检测在预测胸腔积液方面比单独检测CEA具有更高的敏感性和准确性⁸。

在以下研究中，检测了迈迪安Air-Dryable™可风干血液直扩RT-qPCR预混液(MDX121)对经过5%DNA酶处理（以去除RNA检测中的基因组DNA污染）的血清样本中MALAT1 检测的灵敏度（图3）。结果显示，与对比试剂相比，MDX121对血清具有更高的灵敏度和耐受性，更适合lncRNA生物标志物的筛查检测。

  

图 3. 针对MALAT1的相对检测灵敏度-多种癌症的潜在LncRNA生物标志物

MALAT1是为数不多的被充分研究的lncRNAs，在多种肿瘤组织和细胞中有更高的表达和活性，在肿瘤侵袭转移过程中发挥关键作用。本实验中对比了Air-Dryable™ 可风干血液直扩RT-qPCR预混液（MDX121，红色）和QuantaBio UltraPlex™ 1-Step ToughMix（绿色）对经过5%DNA酶处理的血清样本中MALAT1检测的灵敏度。血清样本中加入DNA酶 在 37°C 热浴2小时后，经过95°C 加热10分钟失活。扩增设置为50°C 10分钟；95°C  3分钟；95°C  10秒，60°C  25秒，40个循环。结果显示，与对比试剂相比，MDX121对血清具有更高的灵敏度和耐受性，更适合lncRNA生物标志物的筛查检测。

 

对尿液中生物标志物的检测

 

液体活检主要集中在对血液样本的检测，但也可以使用粪便、唾液和尿液等其他体液。特别是，尿液在泌尿系统相关的癌症和非泌尿系统癌症(如前列腺癌⁹ )中显示出了巨大的前景，并且由于尿液的采集完全没有侵入性，可以大量收集，是ctDNA的丰富来源，因此与血液相比，使用尿液作为检测样本具有显著的优势。

目前有几种基于qPCR的膀胱癌检测和监测的液体活检方法已经获得了FDA的批准，这种检测方法有助于降低膀胱癌患者的经济负担，提高患者的依从性¹⁰。这些检测大多是筛查在膀胱癌的1-4期出现的mRNA生物标志物的过度表达，包括细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDC2)，胰岛素样生长因子结合蛋白5 (IGFBP5)和肝素结合细胞因子 (MDK)。

在以下研究中，对比使用了迈迪安 Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混液(MDX151) 和UltraPlex™ 1-Step ToughMix 对10%尿液样本中膀胱癌标志物CDC2, IGFBP5 和 MDK的检测 (图 4)。

研究显示，Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混液（MDX151）对尿液中的三个RNA靶标都有更灵敏的扩增，Ct值更低。  

  

图4. 对比Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混液（MDX151，红色）, 和UltraPlex™ 1-StepToughMix （灰色）对10%尿液样本中膀胱癌标志物CDC2, IGFBP5 and MDK的检测。在QuantStudio 扩增仪上对10%经DNA酶处理的尿液样本中200pg的CDC2, IGFBP5 或MDK RNA进行扩增。扩增设置为50°C 10分钟；95°C 2分钟；95°C 10秒，60°C 20秒，50个循环（图4）。结果显示，与对比试剂相比，Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混液对尿液中的三个RNA靶标都有更灵敏的扩增，Ct值更低。

 

目前，前列腺癌的金标准筛查方法是PSA(前列腺特异性抗原)测试，如果PSA水平升高，需通过活检进一步检查。虽然这被证明是一种非常有效的诊断方法，但组织活检的癌症检出率很低，在36% - 54%之间，因为并非所有PSA抗原升高的结果都是由癌症引起的¹¹。此外，经常需要重复活检，而每次手术都有严重感染和住院的风险。

前列腺癌抗原3 (prostate cancer antigen 3，PCA3)于1995年首次被发现，是一种前列腺特异性的非蛋白编码RNA，也称为DD3，位于9号染色体的长臂上，在前列腺癌组织中的表达水平高于邻近的非癌组织，而在正常组织和其他前列腺相关疾病中未见表达水平。

几项研究表明，PCA3可以作为前列腺癌的预后标记物，因为它不会像其他生物标志物那样受患者年龄、前列腺炎症、前列腺体积或创伤等因素影响,特别是与其他预测标记物结合使用时，PCA3尿液定量检测已被引入临床实践¹²。

在以下研究中，使用了迈迪安 Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混液 (MDX151) 对5% DNA酶处理的人体尿液样本中PCA3的检测（图5），结果显示使用MDX151最低可至低于10拷贝RNA靶标。

  

图 5. 对5% DNA酶处理的人体尿液样本中前列腺癌抗原3 (PCA3) 检测

使用了迈迪安 Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混液（MDX151，橙色）对5%DNA酶处理的人体尿液样本中10倍连续稀释的RNA靶标（分别为10,000，1,000，100和10个拷贝）和已知浓度的长非编码RNA靶标（PCA3）进行扩增。反应QuantStudio 扩增仪上进行，扩增程序为50°C10分钟；95°C 3分钟；95°C 10秒，60°C 25秒，50个循环。结果显示，Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混液对人体尿液中的PCA3有超强的检测灵敏度。

 

Minimal residual disease (MRD)

 

除了早期癌症筛查外，另一个重点研究领域就是治疗后的疾病监测，以寻找最小残留疾病(MRD)，即癌细胞在治疗后仍存在于体内。这些细胞低于成像研究的分辨率和检测水平，被认为是癌症复发的主要原因。

目前液体活检用于MRD的概念在白血病中相对较成熟，通过越来越灵敏的采样技术使临床医生能够检测到越来越低水平的MRD。此外，由于肿瘤细胞的可及性有限，与血液系统恶性肿瘤相比，实体肿瘤监测一直具有挑战性，而如今随着液体活检检测的灵敏度和特异性的提高，也成为可能。

 

 

总结

液体活检正在彻底改变临床肿瘤学领域，为更便利的肿瘤取样，通过重复取样进行持续监测，对治疗耐药性的筛查，并为制定个性化治疗方案提供机会。这项技术仍在不断发展，其非侵入性的优势有望开启临床肿瘤学的新时代。
 随着qPCR灵敏度和可重复性方面的局限性被克服，针对液体活检相关的挑战也有了解决方案。使用粗样本来提高灵敏度，降低检测的复杂性和成本就是一种有效的解决方案，它可以更容易地和临床甚至护理点检测相整合，为改善临床结果和与癌症治疗相关的医疗支出提供了更多机会。
 液体活检中的泛癌种早期检测 (multi-cancer early detection，MCED)，可以在没有任何疾病体征或症状的健康人群中筛查多达50种癌症。去年，美国拜登政府公布将MCEDs定为18亿美元的癌症登月计划(Cancer Moonshot)的重点项目。癌症登月计划是一项联邦政府计划，于2016年启动，旨在加快癌症研究的进展，改善癌症预防工作。目前至少有20家公司正致力于开发MCED检测，但目前尚未由通过FDA认可或批准的检测。 

迈迪安开发的 Specimen-specific™ 特定样本类型qPCR预混液具有超高灵敏度，能够准确地检测个位数的靶标，如循环肿瘤DNA（ctDNA）。这系列预混液有更强的抑制物耐受性，可以直接用于血液、唾液、尿液或粪便样本的检测，省去DNA或RNA提取的步骤。

 

迈迪安的所有产品都可以提供商业大规模生产，符合ISO13485标准，并大量用于全球各种获得认证的商用检测中。
 

↓现在赶紧联系我们订购样品吧↓

进入-》迈迪安丁香通商铺

咨询详情订购样品：

电话：010-85660600

邮箱：info.cn@meridianlifescience.com
 

迈迪安的所有产品都可以提供商业大规模生产，符合ISO13485标准，并大量用于全球各种获得认证的商用检测中。

美国迈迪安生物科技是一家大规模生产各种抗体，各种病毒抗原，各种重组蛋白质，各类 PCR 多聚酶，各种核苷酸和体外诊断关键试剂的大型领军企业。45年以来，迈迪安生命科学公司始终坚持以提供创新的生命科学解决方案和建立值得信赖的合作伙伴关系为我们的宗旨。我们的重点是为体外诊断试剂公司提供优质的原料和服务，使其有助于推动这些领域的发展。