逆转录酶(Reverse Transcriptase)是一种用于从RNA模板生成互补DNA (cDNA)的酶，是cDNA合成和RT-qPCR反应中的核心成分。为RT-PCR反应选择最佳的MMLV逆转录酶取决于多个因素，例如性能和价格等。

本文中将重点从提高逆转录效率和灵敏度的角度分享如何选择合适的逆转录酶。

逆转录酶主要包括以下三种活性：

①逆转录活性：以RNA为模板，催化dNTP聚合，生成DNA-RNA杂合双链。②RNase H活性：水解杂合双链中的RNA，得到与RNA互补的DNA单链（cDNA）。③DNA指导的DNA聚合酶活性：以cDNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成双链DNA。

 

目前通过深入研究的逆转录酶包含:

• 人类免疫缺陷病毒1型的逆转录（PDB：1HMV）

• 莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶（MMLV）

• 禽成髓细胞瘤病毒的逆转录酶 （AMV）

• 维持真核细胞的染色体端粒存在的端粒酶逆转录酶

其中MMLV和AMV是分子PCR检测常用的两种逆转录酶，尤其是MMLV最为常见，它一种重组DNA聚合酶，可以从单链RNA、DNA或RNA:DNA杂交中合成互补的DNA链。 与AMV 相比，MMLV缺乏DNA内切酶活性，RNase H活性较低。具体对比总结如下：

逆转录酶是由不同生化活性的不同结构酶组成，其中决定逆转录酶性能的主要取决于它的逆转录活性和RNaseH 活性。而逆转录活性又是和酶的热稳定性密切相关的。

 

• 热稳定性

 

传统MMLV不耐高温，只能在相对较低的温度(~50°C)下维持其酶活性。但是在cDNA合成的步骤当中，较高的逆转录温度有助于RNA二级结构的打开和高GC含量的RNA的变性，并且提高引物与目标基因结合的特异性，从而能增加cDNA合成的产量和随后PCR的扩增效率。

 

与野生型MMLV逆转录酶相比，野生型AMV逆转录酶展现出更高的热稳定性，但是它的cDNA合成率和RNaseH 活性较高，因此经过基因工程改造的可耐高温的MMLV逆转录酶是更好的选择。

 

• RNase H活性

 

逆转录酶的一个内在特性是RNase H活性，使得在cDNA合成过程中同时切割RNA：cDNA杂合链中的RNA模板。

 

 由于RNA模板在全长逆转录完成之前可能被降解，RNase H活性是长片段cDNA合成过程中需要规避的因素。RNase H活性还可能会与逆转录酶中的活性聚合酶竞争从而降低逆转录效率。为了更好地合成cDNA，通过在逆转录酶的RNase H结构域中引入突变，逆转录酶的RNase H活性降低甚至完全消除。这种突变常常可以增加长链cDNAs的产量，促进其合成。

 

迈迪安提供几种不同的逆转录酶，适用于所有类型的RT-qPCR检测，包括检测具有高二级结构的RNA（如病毒基因组），或需要无甘油配方的常温稳定的检测。 

 

最优推荐

经过优化，迈迪安推出的55C MMLV（MDX117)，是一种耐高温逆转录酶，具有低RNase H活性和高抑制物耐受性，与其他耐高温逆转录酶相比，有更高的cDNA合成率。它可以在高达60°C的温度下的完成第一链cDNA合成，适用于具有高二级结构(如病毒基因组)的RNA的高效cDNA合成。因为其耐高温的特性，也能适用于部分RT-LAMP反应 （具体效果将取决于LAMP反应的温度）。 

  

• 抑制物耐受性

 

想要提高逆转录效率，除了选对MMLV以外，反应体系对RNA 模板的亲和力也会影响逆转录酶的合成能力。

临床样本如血液和粪便的肝素和胆汁盐，来自土壤和植物的腐殖酸和多酚，以及来自福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）样品的福尔马林和石蜡都会对通过与RNA结合或降低酶活性，从而抑制逆转录的效率。使用对样本更有抗抑性的缓冲液 (如MDX075)能很好克服这种抑制提高逆转录合成效率。 体系中加入RNA酶抑制剂（MDX056），减少RNA模板降解，也是提高逆转录效率的方法。

 

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Meridian迈迪安生物科技在PCR核心酶和反应化学配方研发方面拥有超过20年的专业技术，持续专注开发优化用于DNA和RNA检测的创新高效酶，多年来也一直对MMLV逆转录酶进行不断地改进和优化。

尤其是55C MMLV-RT (MDX117)是一种热稳定性逆转录酶，相比起市售的其他任何耐热RT酶能提供更快、更灵敏的cDNA合成。除此以外，它的价格更低，性价比极高，可帮助您节省原材料成本，这在当今的商业环境中至关重要。

 

迈迪安转录酶:

• 热稳定55C MMLV-RT (MDX117)
• 可冻干MMLV-RT (MDX042）
• RNA酶耐受MMLV-RT(MDX043)

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