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公司新闻/正文
用于MDA/RCA等温扩增的超级DNA扩增利器——Phi29 DNA聚合酶
1140 人阅读发布时间：2025-05-15 12:51
想象一下，有一种酶，能够在恒温条件下快速、高效地扩增DNA，同时保持极高的保真度，甚至可以轻松扩增长达70 kb的长片段DNA！
这听起来像是科幻小说中的情节，但Phi 29 DNA聚合酶让它成为了现实!
Phi29 DNA聚合酶
Phi29 DNA聚合酶的‘超能力’
Phi 29 DNA聚合酶内置3’→5’核酸外切酶校正活性，能够在扩增过程中自动校对错误，其保真度是Taq酶的1000倍 （错误率约10-6），高于目前绝大多数高保真酶的保真度，可保证扩增反应的高保真性，确保DNA复制的准确性。无论是基因测序还是突变检测，它都能提供可靠的结果。
Phi 29 DNA聚合酶TPR1和TPR2亚结构域赋予其强大的链置换活性，使其能够高效解链并复制复杂的DNA结构。因此，在体外条件下，该酶可在恒温环境中边合成边置换完成DNA扩增，而无需依赖热循环，展现出卓越的复制性能， 可轻松处理高GC含量或二级结构复杂的DNA模板，扩增效率远超传统酶。
Phi29 DNA聚合酶具备强大的5'-3'DNA聚合活性，主要归因于其独特的结构设计。它由Palm、Thumb和Fingers三个关键结构域组成，这些结构共同形成了一个高效的催化中心，使酶能够以5'-3'方向合成DNA。
凭借对单链DNA或RNA的高度亲和性和强大的延伸能力，该酶在单次反应中可连续合成超过70kb的DNA片段，为高保真、长片段DNA扩增提供了有力支持。
Phi29 DNA聚合酶的应用
多重置换扩增（MDA）技术凭借其对微量样本（如单细胞或痕量DNA）的高灵敏度扩增能力，能够将皮克级核酸扩增至微克级，同时保持完整的基因组覆盖度与低偏好性。这一特性使其成为单细胞基因组学、法医微量DNA分析及病原体检测等领域的首*选方法。
MDA的核心机制基于随机设计的六核苷酸引物与Phi29 DNA聚合酶的协同作用，在恒温反应体系中实现DNA的高效复制。该技术的成功依赖于Phi29聚合酶的三大特性：
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持续合成能力：单次结合模板即可延伸数千碱基，避免频繁解链；
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高保真性：复制错误率极低（约10-6），确保扩增产物的准确性；
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链置换活性：无需高温变性，通过酶促反应直接剥离模板双链，推动等温扩增循环。 MDA反应过程
在具体反应中，六聚体引物随机结合至目标DNA的不同区域，Phi29聚合酶随即启动多点同步复制。新生成的DNA链通过置换作用分离原始双链，释放的单链可立即作为新模板进入下一轮扩增，形成指数级增长的级联反应。
MDA技术已被广泛应用于单细胞基因组测序、SNP分析及稀有突变检测等领域，为肿瘤异质性研究、胚胎发育追踪及微生物群落分析提供了高分辨率的技术支撑。
滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA）是一种基于环状DNA分子滚环复制机制的核酸扩增技术，其核心在于模拟自然界中微生物环状遗传物质的复制过程。该技术以环状DNA（如质粒或噬菌体基因组）为模板，通过一条与模板部分区域互补的短链引物启动反应，并依赖Phi29 DNA聚合酶实现高效扩增。
Phi29 DNA聚合酶在此过程中发挥关键作用，其强持续合成能力允许单次结合模板后延伸数万碱基而无需反复解离，同时凭借低于10-6的错误率确保产物的高保真性。此外，该酶的链置换活性可在恒温条件下直接剥离模板双链，推动新合成DNA链的持续延伸与旧链的置换，从而维持扩增反应的循环进行。
RCA反应过程
在典型RCA反应中，引物结合环状模板后，Phi29聚合酶沿环状结构持续延伸，新生成的单链DNA逐步取代模板互补链，最终形成由重复单元构成的长单链产物（长度可达数十kb）。为进一步提升扩增效率，可通过引入与延伸产物互补的第二引物发展超分支RCA，形成多级分支结构，实现产物的超指数增长。
纳米孔测序技术中Phi29 DNA聚合酶作为核心马达蛋白（Motor）发挥着不可替代的作用，其独特功能直接决定了测序效率与准确性。
Phi29 DNA聚合酶通过结合单链DNA模板并水解ATP提供驱动力，以可控速率牵引核酸分子线性穿过纳米孔，避免因无序穿膜导致的信号混乱。该酶的两大特性使其成为纳米孔测序的理想驱动元件：
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持续合成能力：单次结合模板可连续延伸数千至数万碱基，显著提升核酸穿膜的连续性，减少因酶频繁解离-再结合引发的测序中断；
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链置换活性：在驱动双链DNA（dsDNA）进入纳米孔前，可主动解旋双链结构，释放单链核酸供纳米孔读取，这一特性使其无需额外解旋酶辅助即可处理复杂二级结构的DNA。
在文库构建中，Phi29 DNA聚合酶通过特异性识别并锚定于核酸片段末端的化学接头，形成稳定的“酶-核酸复合体”，确保目标分子定向进入纳米孔。其高保真性进一步保障了长读长测序中序列的可靠性，尤其在解析高度重复区域或结构变异时优势显著。
Phi29 DNA聚合酶在纳米孔测序马达蛋白中
此外，相较于RecD、Dda等解旋酶类马达蛋白，Phi29 DNA聚合酶对反应条件的宽容性更高，兼容更广泛的pH与离子强度范围，降低了实验优化的复杂度。
当前，基于Phi29 DNA聚合酶的纳米孔测序技术已成功应用于病原体实时检测、癌症基因组结构变异分析及表观修饰直接识别等领域。
例如，在新冠病毒基因组测序中，其长读长能力可一次性跨越全长约30 kb的RNA逆转录产物，避免短读长技术所需的片段拼接误差。
在肿瘤研究中，则能精准捕捉染色体易位、基因融合等低频事件，为精准医疗提供高置信度数据支撑。
未来，通过定向进化或理性设计对Phi29 DNA聚合酶进行工程化改造（如增强穿膜速率调控、适配新型纳米孔材料），将进一步拓展该技术的应用边界与性能极限。
迈迪安推出全新Phi29 DNA聚合酶
迈迪安推出的Phi29 DNA聚合酶具有以下几个特点：
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无甘油：可兼容冻干，适用于常温稳定检测的开发，提高检测稳定性
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高浓度：100 U/μL，提高反应灵活性，兼容高通量和POC检测
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超灵敏：对极低量DNA靶标进行超长高效扩增
更大DNA产量
通过RCA法检测Meridian无甘油Phi29 DNA 聚合酶 MDX240（红色）的DNA聚合活性，以扩增单链环状噬菌体DNA，并与QIAGEN的高浓度Φ29 DNA 聚合酶（黑色）进行对比。结果表明，无甘油Phi29 DNA 聚合酶MDX240的DNA聚合活性优于其他供应商的产品。
无甘油Phi29 DNA 聚合酶 MDX240在其反应缓冲液中进行冻干处理，并通过加速稳定性实验进行测试。冻干酶（红色）在 37°C 下孵育一个月后，通过RCA反应检测其DNA聚合活性，并与存储于 -80°C 的液态等分试样（蓝色）进行比较。结果表明，冻干MDX240仍保持活性，并预计在常温下可稳定保存长达 12 个月。
反复冻融稳定性
甘油是一种常用于储存缓冲液的低温保护剂，可在冻存过程中保护 Phi29 DNA 聚合酶。为评估无甘油Phi29 DNA 聚合酶 MDX240对冻融的耐受性，实验进行了冻融稳定性测试，包括 5 次和 10 次冻融循环，并与未冻融的新鲜酶（0 次冻融）进行对比。采用滚环扩增（RCA）实验检测其扩增单链环状噬菌体 DNA 的能力。结果表明，无甘油Phi29 DNA 聚合酶 MDX240具有良好的稳定性，在多次冻融后仍保持与新鲜酶相同的性能。
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Meridian迈迪安致力于提供最高质量的分子原料酶制剂，全球研发生产基地均通过了 ISO 13485认证。我们始终坚持以客户为中心，以高质量的服务和产品为合作伙伴提供价值。
迈迪安产品主要优势包括：
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一致性：单批次量产，保证可靠的检测
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优质性能：通过严格质控，减少批间差及污染
美国迈迪安生物科技是一家大规模生产各种抗体，各种病毒抗原，各种重组蛋白质，各类 PCR 多聚酶，各种核苷酸和体外诊断关键试剂的大型领军企业。45年以来，迈迪安生命科学公司始终坚持以提供创新的生命科学解决方案和建立值得信赖的合作伙伴关系为我们的宗旨。我们的重点是为体外诊断试剂公司提供优质的原料和服务，使其有助于推动这些领域的发展。
