01 二代测序NGS

NGS，Next Generation Sequencing，也被称为高通量测序或深度测序。NGS是一种革命性的DNA或RNA测序技术，能够在相对较短的时间内、同时测序多个DNA或RNA分子，从而实现对基因组、转录组、表观基因组等的全面分析。

 

相比传统的Sanger测序技术，NGS具有更高的通量、更快的速度和更低的成本的优势：

-平行测序：同时对数百万个DNA 片段进行测序

-高通量：快速生成大量基因组数据(3Mb-30Gb/天)

-成本效益高：以较低的单位碱基成本实现全面测序

 

 

NGS技术基于不同的原理和平台，但其基本工作流程包括以下几个步骤：

1. 文库制备：样品DNA或RNA被提取并转化为文库，包括文库构建、片段化和适配序列添加等步骤。

2. 测序：文库中的DNA或RNA片段被固定在平台上，并进行大规模并行的测序反应。不同的NGS平台采用不同的测序原理，如化学荧光标记（例如Illumina）、纳米孔（例如Oxford Nanopore）或半导体芯片（例如Ion Torrent）等。

3. 数据分析：测序得到的原始数据被传输到计算机中进行处理和分析。这包括数据质量控制、序列比对、变异检测、基因表达定量等一系列生物信息学分析步骤。

NGS技术已经在基因组学、转录组学、蛋白质组学、表观遗传学等领域取得了广泛应用，推动了生命科学领域的许多重大突破，如人类基因组计划、癌症基因组学、微生物组学等。NGS的发展也为个性化医疗、精准医学、农业基因组学等领域带来了革命性的变革。

 

02 NGS市场发展

 

总体来说，NGS技术已经从科研走向了临床，成为医疗保健领域的重要工具之一，可帮助人们深入了解基因构成和各种疾病的易感性，通过识别致病变异，实现对癌症、传染病、罕见基因变异、产前异常以及可能影响治疗反应的药物基因变异的早期准确检测，从而大幅改善患者的治疗效果。

 

目前NGS主要的技术包括以下几种：

1. 454测序技术：454测序技术是Roche公司开发的一种基于串联合成反应（Sequencing by Synthesis，SBS）的测序技术，利用荧光信号检测DNA合成的过程来实现DNA测序。虽然目前454技术在NGS市场上的份额已经较小，但其仍然在一些特定应用领域有一定的市场需求。

2. Illumina测序技术：Illumina是目前NGS市场上应用最广泛的技术之一。其基本原理是利用DNA合成、扩增和测序的方法来实现高通量的DNA测序。Illumina技术具有高度的准确性、可靠性和通量，适用于全基因组测序、转录组测序、甲基化分析等多种应用。

3. Ion Torrent测序技术：Ion Torrent技术是一种基于半导体芯片的测序技术，采用了无化学荧光标记的DNA测序方法。Ion Torrent测序技术具有简化的工作流程、较短的实验周期和较低的设备成本，适用于小规模实验室和临床诊断应用。

4. PacBio测序技术：PacBio技术采用了单分子实时测序（Single Molecule Real-Time，SMRT）技术，能够实现长读长的DNA测序。PacBio技术具有高度的读长和低错误率的特点，适用于结构基因组学、复杂基因组结构分析等领域。

5. Oxford Nanopore测序技术：Oxford Nanopore技术是一种基于纳米孔测序原理的技术，通过电子信号检测核酸分子在纳米孔中的穿过过程来实现DNA或RNA的测序。ONT技术具有实时测序、便携式设备和长读长等特点，适用于野外环境、迅速诊断和移动医疗等应用。

 

这些主要的NGS技术各自具有特点和优势，适用于不同的实验目的和应用场景。随着技术的不断发展和创新，NGS领域的技术和平台也在不断更新，为科学研究、临床诊断和生物工业等领域提供更加丰富和强大的工具。 随着Solexa/Manteia/Illumina 专利开始到期， 势必对NGS市场发展产生影响，具体影响可能包括：

- 更新的NGS 平台

- 给 Illumina 带来试剂定价压力

- 使用新试剂开发新（或更新）技术

 

目前有多家诊断企业主要提供基于NGS的肿瘤检测，对基因变异进行分析，并将其与发生病变（通常是肿瘤性病变）的可能性联系起来。对于已经确诊的病变，进一步确定其特征。例如，生成有关其预后、演变或对药物治疗的预期反应的信息。这些检测包括泛癌种检测，如Foundation One或Guardant 360，也可以针对某些病理中的关键突变进行特异性检测，如非小细胞肺癌中的 HER 受体。有些甚至针对RNA，如Caris 开发的Mi Transcriptome。

 

03 NGS应用中的障碍

 

《自然医学》（Nature Medicine）杂志最近发表的一篇文章指出，86% 的基因组学研究都是在欧洲后裔中进行的¹ ，这凸显了全球在基因检测的可用性和可及性方面存在的巨大差距。

因此，目前可用的基因组数据缺乏来自所有人群的代表性，无法捕捉不同种族和地理区域的基因多样性。许多疾病在患病率、严重程度和对治疗的反应方面都会因受种族和血统影响的遗传因素而有所不同。如果没有足够的代表性，基因组研究在解决非欧洲人群疾病遗传基础方面的有效性就会受到很大限制。

 

要实现 NGS 的广泛应用，必须克服几个障碍，以提高其可负担性和可获得性。2007 年，单个人类基因组的测序成本超过 1,000 万美元² ，尽管自那时以来，总体可负担性有所改善，但由于税收以及分析、运输和基础设施的高成本，低收入国家的测序成本仍可能是高收入国家的五倍。具体而言，低收入国家面临的挑战包括样本处理协调、试剂成本和采购、质量保证程序以及数据管理。

 

从伦理角度来看，还需要确保基因组研究的利益得到公平分配，边缘化群体不被利用。在努力实现 NGS 技术和基因组数据获取民主化的同时，还能采取措施解决医疗保健获取方面的差距，促进包容性，并优先考虑弱势群体的需求和观点³。

 

04 NGS的进步与技术发展

 

NGS技术未来的发展方向包括以下几个方面：

1.     单细胞测序技术的发展

2.     长读长测序技术的改进

3.     实时测序技术的进

4.     多组学数据整合与分析

5.     便携式和微型化POC设备的发展

6.     人工智能和机器学习在数据分析中的应用

 

总的来说，NGS技术未来的发展方向将是更加高通量、高分辨率、便携化和智能化，以满足不断增长的科研和临床需求，并为生命科学领域带来更多的突破和创新。

 

硬件和软件方面的进步使各种规模的实验室都能以更快的速度和更低的价格进行测序，以推动NGS市场的扩大及其在新环境中的应用。适用于低样本量的测序仪的价格与高样本量用户的价格相当，减少测序的集中化程度，提高样本和所产生数据的民主化程度和控制能力。

 

尤其是，新的测序技术使产品无需冷链或温控物流即可运输和使用，可兼容便携式POC设备， 这一创新将能解决许多国家面临的关键挑战，因为冷链物流可能成本高昂、物流复杂，而且有时在资源有限的环境中无法使用。使当地实验室能够进行自己的NGS检测，无需将样本送往其他国家，在整体上最大限度地降低成本，加快了交付周期，并减少了样本处理物流。

 

总之，随着NGS技术的更亲民化和测序成本的持续下降，其应用将继续扩展到新的领域，而云NGS信息学平台、机器学习和AI等新工具的融入，将进一步推动其在全球医疗保健变革中的作用⁴。

 

05 迈迪安NGS解决方案

 

对于 NGS 开发研究人员来说，通过冷链储运测序检测试剂盒昂贵且不方便，这不利于NGS检测普及到更广泛的地区。开发可常温储运的测序检测试剂被认为是可持续发展的替代方案，有助于突破运输和储存能力引起的普及化限制。

 

Meridian迈迪安近日全新推出了一系列无甘油NGS建库分子酶，可以实现冻干常温储运，简化运输物流，不仅减少包装材料和运输成本，而且还能减少冷链储运造成相关的碳排放，符合迈迪安坚持为体外诊断开拓可持续性创新原料的战略。

 

该系列酶以高浓度形式，满足了POC设备对微型化的要求。通过使用更小的反应体积量，最大化上样量的同时，确保性能的一致性，提高检测林敏度。迈迪安的新型无甘油高浓度酶进一步助力NGS研发人员设计下一代 POC NGS检测。

 

除此以外，迈迪安还可以为特定的 NGS 应用定制冻干试剂，根据需要提供冻干球定制服务。

Meridian生命科学部门总裁Lourdes Weltzien博士说：“在 Meridian，产品创新背后的驱动力是我们对理解和减轻客户挑战的坚定承诺。随着我们全新无甘油NGS酶产品系列的推出，消除客户在处理NGS应用关键原材料时遇到的物流障碍，旨在助力IVD企业能够在全球范围内提升和拓宽他们的NGS能力。”

 

总结来说，此次迈迪安推出的全新NGS酶产品主要优势包括：

• 不含甘油，可兼容冻干，在常温下储运 

• 高浓度，适用于POC便携式NGS测序设备 

• 最大限度地增加上样量，提高灵敏度

   

该系列分子酶覆盖了NGS建库的各个阶段，具体包括：

 

1. T4 DNA 聚合酶 I Klenow大片段

T4 DNA 聚合酶I Klenow大片段是来自大肠杆菌DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物。该酶由大肠杆菌表达，表达基因的来源为polA 基因片段。T4 DNA聚合酶I Klenow大片段酶活性：

1. 5'→3'DNA聚合酶活性：可以在结合有引物的单链DNA 模板上，催化将核苷酸添加到 DNA 链的 3' 末端，使其沿 5' 至 3' 方向延伸。

2. 3'→5'外切酶活性：可以用于将5'端突出末端补平或3'端突出末端削平。T4 DNA聚合酶的3'→5'DNA外切酶活性对于单链DNA要比双链DNA活性更高，即单链DNA要比双链DNA中的非配对链部分更容易被T4 DNA聚合酶所消化。

3. 无5'→3'外切酶活性

 

T4 DNA聚合酶I Klenow大片段主要用于：

1. DNA 5'或3'突出末端的钝化

2. 5' 突出端进行标记

3. 定点突变过程中第二链的合成

4. 不依赖于连接反应的PCR产物克隆

5. 通过置换反应进行标记DNA探针合成

在NGS文库制备中T4 DNA聚合酶主要作用是对DNA进行片段化处理后用于末端修复，可钝化双链 DNA 片段的 DNA 末端（填充5'-overhangs 或/和去除3'-overhangs ），以便随后通过 T4 DNA连接酶添加适配子。

 

T4 DNA聚合酶I Klenow大片段的最优反应温度是25°C或室温。75°C加热10分钟可使酶失活。金属离子螯合剂，无机焦磷酸盐(PPi)，大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对其有抑制作用。 

 

迈迪安的MDX208无甘油T4 DNA聚合酶I Klenow大片段提供优化的5x反应缓冲液，缓冲液中含有冻干所需的辅料，提供出色、稳定的性能。

 

该酶以50U/μL提供，远远高于其他同类产品（通常为5-10U/μL），高浓度分子酶适用于开发新一代POC NGS检测，以满足便携、小型化需求。

 

2. T4 DNA 聚合酶

T4 DNA 聚合酶是一种依赖 DNA模板的DNA 聚合酶，其酶活性和作用和上文介绍的T4 DNA聚合酶I Klenow 大片段一样，区别在于：

1. T4 DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比Klenow大片段要高约200倍，如此强大的外切酶活性导致该酶不适用于5'突出末端的标记。

2. 最优反应温度为12°C （Klenow大片段最优反应温度是25°C）。

 

添加10mM EDTA或加热至75°C 10分钟可使酶失活。 金属离子螯合剂可以抑制T4 DNA聚合酶的活性。

 

迈迪安的MDX207无甘油T4 DNA聚合酶以10U/μL提供，并提供优化的5x反应缓冲液，缓冲液中含有冻干所需的辅料，提供出色、稳定的性能。

 

3. T4多聚核苷酸激酶

T4多聚核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase），简称T4 PNK，是一种多聚核苷酸5'羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应：5'-OH + NTP → 5'-P + NDP。

 

上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4 PNK可以显示出5'磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其他NTP也可产生相同的反应：5'-P + NDP → 5'-OH + NTP(最适pH为6.4左右)。

 

当ATP和ADP都适量存在时，T4 PNK可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其他NTP也可产生相同的反应：5'-P + NTP + NDP→5'-P + NDP + NTP。

 

T4 PNK同时具有3'磷酸酯酶活性，可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3'-P → 3'-OH + Pi(最适pH为5.9左右)。T4 PNK的激酶活性在C-末端附近，而磷酸酯酶活性在N-末端附近。

T4 PNK主要用于：

1. 使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行

2. 催化3'磷酸化的单核苷酸的5'磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端连接

3. 去除3'端磷酸基团

 

T4 PNK的最优反应温度是37°C或室温。75℃加热10分钟或加入EDTA可使其失活。金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于50mM的KCl和NaCl均可显著抑制其酶活性。

 

迈迪安的MDX206无甘油T4 PNK以10U/μL提供，并提供优化的5x反应缓冲液，缓冲液中含有冻干所需的辅料，提供出色、稳定的性能。

 

4. T4 DNA连接酶

T4 DNA连接酶提取自T4噬菌体，是DNA重组技术中最常用的DNA连接酶之一，它比大肠杆菌提取的DNA连接酶具有巨大的优势。

T4 DNA连接酶可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5'-P末端和3'-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。

T4 DNA连接酶主要用于：

1. 有效地连接钝端或黏性末端。

2. 修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交链中的单链缺口，（大肠杆菌DNA连接酶只能连接DNA-DNA分子）。

 

在NGS文库制备中T4 DNA聚合酶主要作用是连接双链寡核苷酸连接体或DNA适配子。

 

T4 DNA连接酶的最优反应温度是25°C。65℃加热10分钟可以导致T4 DNA连接酶失活。NaCl或KCl浓度大于200mM时强烈抑制T4 DNA连接酶。

 

迈迪安提供的MDX200无甘油T4 DNA连接酶以50 U/μL的浓度（Weiss Units）提供，比其他市售连接酶的浓度高2-10倍,其在诊断应用中具有更大的灵活性，是微流控和POC检测的理想选择。

 

5. 高保真Pfu聚合酶

在NGS文库制备的过程需要使用PCR扩增，除了增加起始DNA量外，可用于对NGS文库的富集，这些两端连接有接头的片段将附着在流动槽上并进行测序，因此PCR扩增步骤不会向NGS文库引入突变对高质量的测序至关重要。因为较低的错误率意味着需要较少的序列覆盖范围，从而节省费用和时间。普通的Taq聚合酶由于缺乏校对活性，不适合用于NGS文库扩增，而高保真酶由于具有3´→5´ 核酸外切酶活性，是用于NGS文库扩增的理想选择。

 

Pfu是一种热稳定性高保真DNA聚合酶，从激烈火球菌中分离出来。Pfu 聚合酶在镁存在的情况下以 5´→3´ 方向复制 DNA，但也具有 3´→5´ 核酸外切酶（校对）活性。通过这种校对活动，可以快速消除聚合过程中可能发生的碱基错误掺入。高保真Pfu酶的错误率为3.0x10^-6，可生成长度长达5kb的平端扩增子。

 

迈迪安的MDX203高保真Pfu聚合酶以20U/μL的高浓度提供，并搭配优化的5x反应缓冲液，可提供出色、稳定的性能，适用于开发新一代POC NGS检测，以满足便携、小型化需求。

 

迈迪安NGS建库全面解决方案

产品编号	产品名称	作用
MDX207	无甘油T4 DNA聚合酶,10U/μL	末端修复
MDX208	无甘油T4 DNA聚合酶I Klenow大片段，50U/μL	末端修复
MDX206	无甘油T4多核苷酸激酶,20U/μL	磷酸化
MDX011	无甘油Taq DNA聚合酶,50U/μL	A尾
MDX200	无甘油T4 DNA连接酶,50U/μL	链接适配子
MDX203	无甘油高保真Pfu聚合酶,20U/μL	文库富集
MDX041	NGS建库磁珠	清洗&选择大小
MDX039	NGS文库定量试剂盒	文库定量

 

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美国迈迪安生物科技是一家大规模生产各种抗体，各种病毒抗原，各种重组蛋白质，各类 PCR 多聚酶，各种核苷酸和体外诊断关键试剂的大型领军企业。45年以来，迈迪安生命科学公司始终坚持以提供创新的生命科学解决方案和建立值得信赖的合作伙伴关系为我们的宗旨。我们的重点是为体外诊断试剂公司提供优质的原料和服务，使其有助于推动这些领域的发展。