随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入， PCR 已成为一门相当成熟的常规技术。

 

DNA聚合酶是分子PCR反应中DNA扩增的核心酶，为不同的检测应用选择最合适的聚合酶是PCR成败与否及检测性能高低的关键因素。

 

DNA 聚合酶有很多种不同类型，每种都具有不同的性质和特征，包括热稳定性、特异性、持续合成能力、保真度、扩增片段长度和延伸速度等。

 

我们在这儿对分子诊断中最常用的几种聚合酶进行归类比较。

01. Taq DNA聚合酶

 

最初用于PCR的DNA聚合酶是20世纪70年代初期发现的来源于大肠杆菌 DNA聚合酶I上的 Klenow片段，但是这种大肠杆菌酶对热敏感。

 

现代PCR反应中更为广泛使用的是从嗜热细菌水生栖热菌分离出来热稳定性Taq DNA聚合酶。

 

随着蛋白质工程技术的发展，科研人员通过基因突变、结构重组和热启动修饰的方法对Taq DNA聚合酶进行工程改造，使得酶的稳定性、特异性、扩增能力等方面都得到了加强。

 

其中，通过热启动修饰的Taq聚合酶是运用最广泛的。

 

DNA聚合酶在 20℃~37℃下仍有一定聚合酶活性，容易在试剂配制和预热过程产生非特异性的扩增。

 

一种有助于避免非特异性扩增的解决方法是在冰上制备 PCR 反应混合物。较冷的温度有助于降低 DNA 聚合酶的活性；然而，在 PCR 开始之前，仍可能会合成不需要的产物。

 

另一种解决方案是对Taq DNA 聚合酶进行热启动修饰，在PCR开始前DNA 聚合酶活性被封闭，在体系配制及升温过程中没有酶的活性，从而有效防止了非特异性扩增和引物二聚体的形成；在较高温度热激活一段时间后，DNA聚合酶活性得以恢复。使用这种热启动技术DNA聚合酶，可以提高PCR反应特异性和灵敏度。

 

热启动修饰Taq酶活性

Taq DNA聚合酶较为常用的修饰方法为抗体修饰、化学修饰和适配体修饰，几种修饰方法原理各有不同，也有各自优缺点：

热启动修饰技术对比

 

如果想了解更多关于Taq聚合酶的工程改造和热启动修饰的详情，可以点击此处收看迈迪安往期直播回放《“酶”力无穷：赋能卓越的分子诊断性能》：

 

02. 高保真聚合酶

 

通Taq DNA聚合酶不具有外切核酸酶结构域，因此缺乏3´→5´外切核酸酶活性（又叫纠错/校对活性），不具备纠正功能，PCR反应的保真性较低，出现碱基错配的几率为2.1×10^-4左右，因此不宜使用在保真性要求较高的实验，如基因筛选、测序、突变检测等等。

 

而高保真 DNA 聚合酶则具有5'-3'聚合酶活性和 3'-5' 外切核酸酶活性，在PCR扩增过程中，当引物与模板完全互补时，进入聚合域。

 

在聚合酶活性的作用下，游离的脱氧核苷酸通过互补配对的原理依次与引物的3′端结合，新的DNA链从5′端向3′端延伸。

当引物末端结合的核苷酸未与模板配对时，错配的核苷酸会引起结构扰动。新的 DNA 链不能继续向前延伸，然后进入核酸外切酶结构域。在外切酶活性的作用下，错配的核苷酸被切除。切除后，核苷酸会正确重组，新的DNA链可以继续从5'延伸到3'。最终，可以精确复制新的 DNA 链。

 

市面现在最常见的高保真酶是Pfu和KOD两种。Pfu提取自超嗜热古菌激烈火球菌（Pyrococcus furiosus），KOD 提取自柯达热球菌（Thermococcus kodakaraensis）。

 

高保真酶由于具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，这两种原始酶现经过基因工程改造，已经可以实现更高效率，更高的保真性和更快的延伸率。

 

现代市场趋势是使用融合酶，将高保真聚合酶与 双链或单链DNA融合。

 

例如，将来自硫*磺硫叶菌的Sso7d双链DNA通过三个氨基酸连接在Pfu DNA聚合酶的C端上，得到的Pfu-sso7d融合酶，就是现在用的最广泛的Phusion高保真酶，它增加对 DNA 的亲和力并防止聚合酶在 DNA 延伸过程中从DNA模板“脱落”，从而大大提高持续合成能力性，提供更快速和更高保真度的扩增 。

 

Pfu酶的保真度大约是Taq聚合酶的10倍，而这种“新一代”高保真Phusion聚合酶的保真性可以达到Taq聚合酶的 50-300 倍以上。

迈迪安高保真Pfu Mix（MDX006）保证性能与同类高保真酶对比

 

03.Bst聚合酶

 

Bst DNA聚合酶是一种来源于硬脂酸杆菌 (Bacillus stearothermophilus) 的DNA聚合酶I，它具有5’- 3’的DNA聚合酶活性和强链置换活性， 但缺乏5’- 3’的外切酶活性。

 

强链置换活性使Bst DNA聚合酶能够在恒温条件下合成DNA，是等温DNA扩增的理想选择，如环介导的等温扩增（LAMP）、等温螺旋酶依赖性扩增（HAD）和等温多重交叉置换扩增（MCA）。

迈迪安的Bst DNA聚合酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶I的大片段，具有较快的5´-3´DNA聚合活性和强大的链置换活性，搭配优化的缓冲液可提供最快的扩增速度（更快 TTR）、更高的扩增产量、高耐盐性和高灵敏度。

迈迪安无甘油Bst酶（MDX018）的快速扩增性能

 

04. 选择合适的DNA聚合酶

 

选择正确的酶原料对分子诊断检测的成功至关重要！

 

Meridian迈迪安生物科技在Taq聚合酶研发和生产方面具有30年的丰富经验，我们的科学家团队致力于开发最*先进的分子酶，提高检测的精确度和性能，旨在为分子检测提供高性能的诊断原料。

 

多年来，迈迪安坚持通过成熟专业的生产和质控技术，严格控制大肠杆菌污染，保证Taq酶的最优活性。 

 

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更值得一提的是，决定PCR扩增性能的并不只是酶，整个体系的缓冲液配方（盐，pH, Mg，稳定剂，加强剂，核苷酸等）的每一个组分都会影响反应的性能。只有当各组分优化地搭配在一起，才能发挥出酶的最*大活性。

 

迈迪安提供的酶均搭配最适配的已优化好的缓冲液体系，最*大程度简化优化过程，让好的酶达到最优的性能！

 

当各组分优化地搭配在一起，才能发挥出酶的最*大活性，而这正是迈迪安经过几十年的技术沉淀和钻研最擅长的领域！

 

迈迪安提供的酶和预混液均搭配了优化好的缓冲液体系，最*大程度简化优化过程，以达到最优的性能，助力高效的诊断检测开发。

 

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5、高效Taq聚合酶在多种现代分子诊断检测中的实际应用

 

近三十年来，Meridian迈迪安一直是全球分子诊断原料的领军企业，通过不断创新的研发助力分子诊断技术的进步，而无甘油分子酶系列彰显了我们致力于提供前沿分子诊断解决方案的决心。

 

迈迪安高性能分子酶

Taq聚合酶
MDX008	抗体热启动Taq HS
MDX009	化学热启动Taq HS
MDX011	无甘油Taq HS
MDX015	无甘油适配体Taq HS
MDX203	高保真Pfu
Bst聚合酶
MDX012	Bst酶
MDX018	无甘油Bst酶
逆转录酶 & 双功能酶
MDX117	55C 热稳定MMLV
MDX042	可冻干MMLV
MDX205	无甘油Tth DNA聚合酶
‍NGS酶
MDX200	无甘油T4连接酶
MDX203	无甘油高保真Pfu酶
NASBA酶
MDX201	无甘油T7 RNA聚合酶
MDX202	无甘油RNA酶H
MDX120	无甘油RNA酶抑制剂
Coming in 2024	无甘油AMV逆转酶